Nature 子刊：突破！三光子显微镜用于自由活动大鼠深层皮质成像

德国凯撒研究中心的杰森·n·d·克尔团队设计了一种头戴式三光子显微镜，可以对自由运动大鼠深层皮层的神经元活动进行成像。显微镜使用一根空芯光纤，因此在传输1320纳米高能激发脉冲时，传输特性不会随着光纤运动和色散补偿而改变。

此外，显微镜经过优化，可提供快速、短、低功率的光脉冲，以到达深层目标，而不会造成任何功能干扰或物理损伤，然后检测细胞发出的荧光。这些技术改进实现了自由运动大鼠皮层表面以下1.1毫米和更深的成像，其第五层神经元活动的稳定成像可超过1小时。

光学显微镜的迅速发展促进了神经科学的进步。更高的时间空分辨率、更深的大脑区域、更长的记录时间和对动物更小的影响是神经成像技术的追求方向。小型化头戴式双光子显微镜的发展使人们能够在单细胞水平上观察和分析自由运动动物的皮层神经活动。然而，这种双光子显微镜的成像深度止于表层皮层，这使得不可能研究深层皮层和下面的大脑区域。

三光子激发(3PE)可以使用更长的波长(> 1300nm)来减少激发光的散射并消除散焦的荧光，从而极大地扩展了散射组织的成像深度。

这时，另一个问题出现了。为了适用于记录自由运动动物的神经活动，有必要有效地传输光纤并考虑由光纤弯曲引起的偏振状态。克尔团队设计了一种适合三光子激发和传输特性的空光子带隙晶体光纤(HC-PBGF)来解决这个问题。这种光纤可以避免弯曲引起的脉搏变化对神经活动分析的影响。

此外，为了同时降低1320纳米成像的群速度失真(GVD)和三阶色散(TOD)，研究人员通过将双通道双棱镜序列与可变厚度体硅相结合来进一步改善脉冲轮廓。

然后研究人员测试了头戴式三光子显微镜的性能，其横向光学分辨率可达0.8±0.1 μm，纵向分辨率可达5.3±0.5 μm。通过同步图像中每个像素的定时与激光发射脉冲的定时，并通过选通缩短光子探测时间在脉冲时间中的比例，信噪比从0.65提高到2.82左右。在麻醉大鼠中，显微镜的成像深度达到约1343 μm，可覆盖约83%的成年大鼠皮层，而信噪比在不同深度的成像层中是一致的。

三光子激发引起的组织光损伤也是类似于显微镜的痛点之一。研究人员记录了移动光栅刺激时视觉皮层的神经元活动，根据神经元反应的方向偏好进行分类，并发现连续成像50分钟后，神经元反应的方向偏好没有改变，表明长期暴露于三光子激发不会影响神经元功能。

最后，研究人员检查了显微镜在清醒大鼠运动动物成像中的表现。研究人员首先通过一系列行为指标证明，头戴显微镜不会影响老鼠的正常行为，如探索、梳理、进食和追逐。

然后通过对神经元活动成像的分析，证明了不同皮层深度的成像质量是稳定的。同样，研究人员将最初的神经活动与一小时后记录的神经活动进行了比较，两者之间没有显著差异。

克尔团队的头戴式三光子显微镜通过特殊的光纤和改进的成像方法实现了对自由运动大鼠深层皮层的长期记录，这有望实现多种行为的实时三光子记录，并促进更多的生物学发现。

参考:

惠勒、易凯、武阿奎、爱因斯坦、朱明明等。在微阵列上成像的混合CRISPR屏幕揭示了压力颗粒调节因子。Nat方法(2020)。https://doi.org/10.1038/s4159020-0826-8

编者:肖玉干

评论:西蒙(大脑新闻编辑部)

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