高彩霞团队建立新型可预测多核苷酸删除基因组编辑系统
最后更新：2020-06-30 10:49:37 手机定位技术交流文章
作者和韩寒一起扬起了眉毛
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术已被广泛应用于功能基因研究和作物遗传改良，但传统的基因编辑系统在调节功能分析和应用DNA序列方面仍存在局限性。
最近，中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞建立了一个新的多核苷酸靶向缺失系统(英文名称:Apobec-Cas9融合诱导缺失系统，AFDS)，成功实现了水稻和小麦基因组中多核苷酸的准确和可预测的缺失。
北京时间2020年6月29日下午23: 00，《自然-生物技术》在线发表了相关论文。
植物基因组中有多种调控元件、功能基序和非编码DNA，如启动子顺式作用元件、miRNA编码序列、上游开放阅读框序列(uORF)和具有调控功能的基因间区域。
这些DNA序列在调控基因表达、转录和翻译中发挥着重要作用，也是目前基因功能研究和遗传改良的关键目标领域。
sgRNA引导的Cas9核酸酶可在基因组的靶位点产生DNA双链断裂(DSB)，细胞通过非同源末端连接修复(NHEJ)，这通常导致1~3个核苷酸的插入或缺失突变。
然而，这种插入/缺失突变难以有效破坏调节DNA的功能。然而，经典的CRISPR/Cas9不能有效地操纵这些重要的DNA功能元件。
因此，开发一种新的、准确的、可预测的多核苷酸缺失基因组编辑系统，对于调控DNA序列的功能分析和应用具有重要意义。
高彩霞的团队长期致力于植物基因组编辑新技术的研究和开发。在本研究中，基于胞嘧啶脱氨和碱基去除修复(BER)的原理，研究人员首次将野生型β-酪蛋白磷酸肽9与胞嘧啶脱氨酶APOBEC、尿嘧啶糖基化酶(UDG)和嘌呤嘧啶无位点裂解酶(AP裂解酶)相结合，建立了新的多核苷酸靶向缺失系统。
图1: AFID系统介导植物中准确和可预测的多核苷酸缺失。(afid系统工作原理示意图。不同形式的自动指纹识别系统(自动指纹识别系统1~3、自动指纹识别系统3)。(c)afid-3和Cas9之间可预测缺失率的比较。AFID-3和eFID-3之间可预测删除类型的比较。(e)在水稻白叶枯病抗性中，AFID-3介导的可预测的多核苷酸缺失突变体和2 BP插入缺失突变之间的差异。
研究人员说，考虑到植物细胞中的BER系统，他们首先利用具有高脱氨活性的APOBEC3A脱氨酶构建了三种形式的AFID系统(AFID-1~3)，并检测了水稻和小麦细胞中的几个内源DNA靶标。
结果表明，由AFID-3介导的缺失效率高达33.1%，并且产生了从不同5’-胞嘧啶到Cas9切割位点的多核苷酸的缺失，可预测的缺失率超过30%。
然后，研究人员进一步筛选不同的胞嘧啶脱氨酶，发现截短的APOBEC3B脱氨酶(A3Bctd)不仅具有更高的脱氨活性，而且具有更窄的脱氨窗口。
通过用A3Bctd代替AFID-3系统中的A3A，研制了eAFID-3系统。EAFID-3更有效地介导了从优选的TC基序的脱氨基位点到Cas9切割位点的可预测的缺失，其效率是AFID-3的1.5倍。
此外，该研究团队使用AFID-3系统靶向水稻OsSWEET14基因启动子上的效应物结合元件，并获得多核苷酸缺失的突变植物。发现与2 BP插入缺失相比，该系统产生的多核苷酸缺失突变株对水稻白叶枯病的抗性更强。米根。
结果表明，自动指纹识别系统具有高效、准确和可预测的优点。AFID系统的建立可以为植物基因组调控DNA的功能研究和设计育种提供强大的基因组编辑工具。
相关纸张信息:
DOI:10.1038/s 11587-020-0566-4
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